植物無糖組培快繁技術(shù)(Sugar-free micropropagation)又稱為光自養(yǎng)微繁殖技術(shù)(Photoautotrophic micropropagation)是指在植物組織培養(yǎng)中改變碳源的種類,以CO2代替糖作為植物體的碳源,通過輸入CO2氣體作為碳源,并控制影響試管苗生長發(fā)育的環(huán)境因子,促進植株光合作用,使試管苗由兼養(yǎng)型轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)型,進而生產(chǎn)種苗的一種新的植物微繁殖技術(shù)。這一技術(shù)概念是在1980年提出的,其技術(shù)發(fā)明人是日本千葉大學的古在豐樹教授。20世紀90年代以后,這一技術(shù)成為植物微繁殖研究的新領域,受到廣泛的關注,無糖組織培養(yǎng)技術(shù)也在各國開始得到推廣應用。特別是近幾年來,從事這一技術(shù)領域研究的科技人員越來越多,這一技術(shù)也逐漸成熟,并開始應用于植物微繁殖工廠化生產(chǎn)。
1.植物無糖組培快繁的技術(shù)特點
�。�1)CO2代替了糖作為植物體的碳源
在一般的有糖培養(yǎng)微繁殖中,小植物是以糖(如蔗糖、白砂糖、果糖等)作為主要碳源進行異養(yǎng)或兼養(yǎng)生長,糖被看作是植物組織培養(yǎng)中必不可少的物質(zhì)添加到培養(yǎng)基中。而無糖培養(yǎng)微繁殖是以CO2作為小植株的唯一碳源,通過自然或強制性換氣系統(tǒng)供給小植株生長所需CO2,促進植物的光合作用進行自養(yǎng)生長。
�。�2)環(huán)境控制促進植株的光合速率
在傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)中,很少對植株生長的微環(huán)境進行研究,研究的重點是放在培養(yǎng)基的配方以及激素的用量和有機物質(zhì)的添加上;而無糖組織培養(yǎng)技術(shù)是建立在對培養(yǎng)容器內(nèi)環(huán)境控制的基礎上,根據(jù)容器中植株生長所需的佳環(huán)境條件(如光照強度、CO2濃度、環(huán)境濕度、溫度、培養(yǎng)基質(zhì)等)來對植株生長的微環(huán)境進行控制,大限度地提高小植株的光合速率,促進植株的生長。
�。�3)使用多功能大型培養(yǎng)容器
在傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)中,由于培養(yǎng)基中糖的存在,為了防止污染,一般使用或者說只能使用小的培養(yǎng)容器。而無糖培養(yǎng)在培養(yǎng)過程中不使用糖及各類有機物質(zhì),大地避免了污染的發(fā)生,可以使用各種類型的培養(yǎng)容器,小至試管,大至培養(yǎng)室。
�。�4)多孔的無機材料作為培養(yǎng)基質(zhì)
在傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)中,通常使用瓊脂作為培養(yǎng)基質(zhì),而無糖培養(yǎng)主要是采用多孔的無機物質(zhì),如蛭石、珍珠巖、纖維、Florialite(一種蛭石和纖維的混合物)作為培養(yǎng)基質(zhì),可以大地提高小植株的生根率和生根質(zhì)量。
(5)閉鎖型培養(yǎng)室
傳統(tǒng)組織培養(yǎng)中的培養(yǎng)室是半開放的,有許多的窗戶以利于陽光直接進入培養(yǎng)室,但自然光在進入培養(yǎng)室的同時也增加了降溫的成本,而且,一年四季、春夏秋冬,晴天、陰天、雨天,早晨、中午、下午、光的強度和分布是不均勻的。而無糖培養(yǎng)采用的是閉鎖型的培養(yǎng)室,通過人工或自動調(diào)控整個培養(yǎng)室環(huán)境,能周年進行穩(wěn)定的生產(chǎn)。
2.植物無糖組培快繁技術(shù)的優(yōu)勢
植物無糖組織培養(yǎng)技術(shù)改革了傳統(tǒng)的用糖和瓶子作為碳源營養(yǎng)和生存空間的技術(shù)方法,增加了植物生長和生化反應所需的物質(zhì)流的交換和循環(huán),促進植株的生長和發(fā)育,實現(xiàn)了苗低成本的生產(chǎn)。優(yōu)越如下:
(1)通過人工控制動態(tài)調(diào)整優(yōu)化植物生長環(huán)境,為種苗繁殖生長提供佳的CO2濃度、光照、濕度、溫度等環(huán)境條件,提高植株的光合速率,促進了植株的生長發(fā)育,苗齊、苗壯。
�。�2) 繼代與生根培養(yǎng)過程合二為一,培養(yǎng)周期縮短了40%以上。
(3) 大幅度減少了植物微繁殖生產(chǎn)過程中的微生物污染率。
�。�4) 消除了小植株生理和形態(tài)方面的紊亂,種苗質(zhì)量顯著提高。
�。�5) 提高了植株的生根率和生根質(zhì)量,特別是對于木本植物來說,大地植株的生根率和生根質(zhì)量,試管苗移栽成活率顯著提高。
(6) 節(jié)省投資,降低生產(chǎn)成本。與傳統(tǒng)的微繁殖技術(shù)相比,種苗生產(chǎn)綜合成本平均降低30%。
�。�7) 組培生產(chǎn)工藝的簡單化,流程縮短,技術(shù)和設備的集成度提高,降低了操作技術(shù)難度和勞動作業(yè)強度,更易于在規(guī)模化生產(chǎn)上推廣應用。
(8) 培養(yǎng)不受培養(yǎng)容器的限制,可實現(xiàn)穴盤苗商業(yè)化生產(chǎn),也可實現(xiàn)大規(guī)模容器自動工廠化生產(chǎn)。
3.植物無糖組培快繁技術(shù)的限制因素
�。�1)需要相對復雜的微環(huán)境(容器內(nèi)環(huán)境)控制的知識和技巧
植物無糖組織培養(yǎng)微繁殖的研究和試驗已經(jīng)非常成功,但實際應用還是受到一定的限制,其中的一個主要原因就是需要應用微環(huán)境控制方面專業(yè)的技術(shù)。沒有充分理解容器中小植株的生理特性,容器內(nèi)的環(huán)境,容器外的環(huán)境,培養(yǎng)容器的物理或構(gòu)造特性之間的關系,將不可能成功地應用光自養(yǎng)微繁殖系統(tǒng),使用少的能源和原料生產(chǎn)高品質(zhì)的植株。光自養(yǎng)微繁殖控制系統(tǒng)的復雜性會導致設施設計的失敗,必須在充分認識和理解了光自養(yǎng)微繁殖的原理后,才能取得成功。
�。�2)培養(yǎng)的植物材料受到限制
與一般的微繁殖相比,光自養(yǎng)微繁殖需要較高質(zhì)量的芽和莖,外植體需具有一定的葉面積,帶綠色子葉的體細胞胚也可進行光自養(yǎng)生長。外植體的質(zhì)量越好培養(yǎng)效果越佳。
4.植物無糖組培快繁技術(shù)研究進展
植物無糖組織培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過近20年的發(fā)展,基礎理論的建立和研究已經(jīng)成熟,但商業(yè)化的應用還處于起步階段。在植物無糖組織快繁技術(shù)的應用中,CO2的供給和濃度的調(diào)控是其關鍵技術(shù)之一。在植物無糖組織培養(yǎng)過程中,為了增加培養(yǎng)容器中的CO2濃度,可采用兩種不同的CO2補充方式,一種是在密封的容器上使用透氣膜,通過自然換氣方式提供小植株光合作用所需的CO2(Aitken-Christie et al.,1995)。隨著無糖組織培養(yǎng)培養(yǎng)容器的不斷增大,強制性換氣系統(tǒng)得到了應用(Kozai T. et al.,2000;Xiao et al.,2005)。與自然換氣相比,強制性換氣具有CO2濃度容易控制,操用方便,植物生長發(fā)育加快等特點。Xiao等(2005)在對callalily和Chinafir進行的無糖培養(yǎng)研究表明,采用120L的培養(yǎng)容器,通過強制性換氣系統(tǒng)直接輸入CO2供植物生長。與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)方式(培養(yǎng)基中添加蔗糖)相比,callalily的培養(yǎng)周期縮短50%、苗木移栽成活率由50%提高到95%;China fir苗木質(zhì)量顯著提高,繼代和生根過程合二為一,且沒有愈傷組織的發(fā)生,而有糖培養(yǎng)則在基部產(chǎn)生愈傷組織,嚴重影響苗木移栽成活率。Xiao等(2005)等對Gerberas進行的無糖培養(yǎng)研究表明,與有糖培養(yǎng)相比,采用大規(guī)模容器和強制性換氣系統(tǒng)進行的無糖組織培養(yǎng),植株的葉面積、莖干重分別提高5.2和4.6倍,植株的凈光合速率和葉綠素含量分別提高9.2和2.2倍,苗木生根率和移栽成活率分別由62%、57%提高到98%、95%。(Tanaka M. et al.,2005)、(Teixeira J.A. et al., 2006)進行桉樹的無糖組織培養(yǎng)研究表明,一種新型的小培養(yǎng)容器Vitron能提高試管苗在無糖培養(yǎng)條件下的生長質(zhì)量,適合進行無糖組織培養(yǎng)生產(chǎn)。
在植物無糖組織培養(yǎng)中,培養(yǎng)基質(zhì)對試管苗生長來說也是一個非常重要的因素。Afreen-Zobayed等(1999)對甘薯進行了瓊脂、gellan gum、蛭石、cellulose和Florialite等五種不同培養(yǎng)基質(zhì)的無糖培養(yǎng)比較試驗,研究結(jié)果表明,以Florialite為培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)的試管苗質(zhì)量優(yōu)于以瓊脂作為培養(yǎng)基質(zhì)產(chǎn)生的試管苗,其中葉、根鮮重分別是后者的2.4和2.9倍,干重分別是后者的2.2和2.8倍,且以Florialite為基質(zhì)產(chǎn)生的試管苗凈光合速率高。(Xiao et al., 2006)對statice進行的無糖組織培養(yǎng)研究也表明,與瓊脂相比,F(xiàn)lorialite顯著提高試管苗生長和根的發(fā)生,以及凈光合速率。另外,光量子通量(Xiao et al., 2003)、培養(yǎng)容器換氣次數(shù)(Xiao et al., 2006)等環(huán)境因子均對試管苗生長產(chǎn)生影響。
到目前為止,植物無糖組織快繁技術(shù)已經(jīng)在60余種植物中獲得成功。與有糖培養(yǎng)相比,無糖組織培養(yǎng)技術(shù)顯示出其特有的優(yōu)勢。特別是對于木本植物來說,無糖組織培養(yǎng)技術(shù)能顯著改善根的質(zhì)量,提高生根率,消除了小植株生理和形態(tài)方面的紊亂,種苗質(zhì)量顯著提高(Kozai T. et al.,2005)。(Afreen. et al., 2002a, b)以咖啡植物作為研究對象,利用無糖組織培養(yǎng)技術(shù)進行了大量體細胞胚胎發(fā)生方面的研究,研究結(jié)果表明,無糖組織培養(yǎng)能提高體細胞的質(zhì)量,減少玻璃化和不正常體細胞胚發(fā)生機率,而且體細胞發(fā)生發(fā)育時期、大小比較均勻,便于工廠化生產(chǎn)。研究指出,無糖組織培養(yǎng)技術(shù)可能成為體細胞胚胎發(fā)生機理研究的有效工具或途徑。隨著無糖組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善和成熟,這一技術(shù)已經(jīng)開始在商業(yè)上慢慢得到應用和推廣(Kozai T. et al.,2004;Kozai T. et al.,2006)。
5.植物無糖組培快繁技術(shù)應用前景
無糖組織培養(yǎng)微繁殖技術(shù)作為一項高新技術(shù),在基礎科學研究和實踐生產(chǎn)中均具有廣闊的應用前景。
�。�1)在無糖組織培養(yǎng)過程中,主要是通過環(huán)境調(diào)節(jié)來促進試管苗生長。因此,可以從環(huán)境調(diào)節(jié)角度來研究試管苗形態(tài)建成、生長發(fā)育機理等方面的基礎科學研究。
�。�2)無糖組織快繁技術(shù)可有效解決藤木、木本植物生根難的問題,可進行這方面的應用基礎研究。
�。�3)可進行試管苗繼代、生根、馴化同步研究,縮短培養(yǎng)周期。
�。�4)可進行瀕危珍稀植物及高附加值植物的人工培育等方面研究。
�。�5)可進行種質(zhì)資源保存方面的研究。
�。�6)隨著材料科學、物理農(nóng)業(yè)的發(fā)展,以及植物無糖組織培養(yǎng)技術(shù)理論體系的成熟,這一技術(shù)將以低成本生產(chǎn)高質(zhì)量種苗的優(yōu)勢,應用于植物種苗工廠化生產(chǎn)。