馬鈴薯組織培養(yǎng)技術(shù)

　　1、種薯的莖尖脫毒

　　植物組織培養(yǎng)也叫PlantTissueCulture，廣義指在特定條件下，植物生長過程中，將離體的植物組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體，通過人工培養(yǎng)手段，促進(jìn)其分化與生長，并在環(huán)境與技術(shù)的控制下，促使植物完成完整植株，過程生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)的技術(shù)。因?yàn)榻M織培養(yǎng)過程需要脫離母體完成，因此植物組織培養(yǎng)也叫離體培養(yǎng)。狹義指特定條件下，植物中的形成層、葉肉組織、薄壁組織、胚乳等部分，通過培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生的植株，也是對植物器官組織的再培養(yǎng)，通過分化過程變成新的植物。

　　選擇產(chǎn)量較高或抗病能力較強(qiáng)的塊莖洗凈后，在32℃下催芽或自然發(fā)芽。當(dāng)塊莖出芽長約30厘米時(shí)，切取帶頂芽或側(cè)芽的莖段約10～15厘米備用。將莖尖先用自來水沖洗干凈后，用75%的酒精浸泡30s，再用0.1%升汞浸泡8～10min，然后用無菌水沖洗3～4遍后，在顯微鏡下剝?nèi)蓚€(gè)葉原基的莖尖接種到裝有脫毒培養(yǎng)基的試管斜面上，每個(gè)試管內(nèi)接種一塊愈傷組織，在25℃左右的培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。脫毒培養(yǎng)基一般為MS培養(yǎng)基中加入0.5mg·L-16-BA、0.1mg·L-1GA3和0.1mg·L-1NAA。觀察其生長狀況，剔除污染及未成活的試管苗。

　　2、試管苗擴(kuò)繁

　　配制好MS培養(yǎng)基后，趁熱分裝入三角瓶中，進(jìn)行高壓滅菌。觀察3～5天，剔除污染的試管后，準(zhǔn)備接種。將工作服、套袖、剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿等進(jìn)行高壓滅菌。將拖鞋及滅菌好的工作服放入緩沖間，對接種室的空間進(jìn)行熏蒸消毒，每接種一個(gè)星期左右熏蒸一次。將盛裝75%的酒精瓶放在超凈工作臺(tái)附近，在工作臺(tái)內(nèi)放入酒精燈、打火機(jī)、浸泡的酒精棉球、滅菌器等所需物品，每次接種前需將超凈工作臺(tái)用紫外燈進(jìn)行殺菌半小時(shí)左右，20min后工作人員方可進(jìn)入。

　　接種人員先換上拖鞋、剪掉手指甲、用香皂洗凈雙手后，進(jìn)入到緩沖間內(nèi)。換上拖鞋及工作服后，進(jìn)入接種室，用75%的酒精對雙手、套袖進(jìn)行噴霧消毒，然后就座于超凈工作臺(tái)前，點(diǎn)燃酒精燈，用酒精棉球?qū)﹄p手及臺(tái)面進(jìn)行消毒，將試管先用酒精棉球擦拭，然后用酒精燈輕微灼燒試管口及棉塞，在酒精燈火焰下10cm以內(nèi)拔掉棉塞，將鑷子在酒精燈火焰下灼燒，帶晾涼后夾出試管苗，用剪刀剪掉剩余培養(yǎng)基后，將試管苗放在培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿在酒精燈附近10cm內(nèi)。將剪刀進(jìn)行酒精燈火焰灼燒晾涼后，用剪刀將試管苗剪為數(shù)段，每段要留1片小葉。將帶有培養(yǎng)基的三角瓶先用酒精棉球擦拭，然后在酒精的火焰下對瓶口進(jìn)行消毒，稍涼片刻，用鑷子將試管苗在酒精燈火焰下10cm以內(nèi)接入到三角瓶內(nèi)，每瓶接種10段左右，火焰封口后，貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上要標(biāo)注接種時(shí)間、品種及接種人。重復(fù)此操作直至將培養(yǎng)皿內(nèi)的苗全部接完后，將培養(yǎng)皿用酒精棉球擦拭，在酒精燈火焰下灼燒后放回原處，進(jìn)行下一個(gè)試管苗或另一個(gè)品種的接種操作。

　　接種結(jié)束后，將接種好的三角瓶放到培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，25℃左右，每天用照明燈補(bǔ)光，光照16h，觀察其生長狀況，剔除污染及未成活的試管苗。一個(gè)月左右后進(jìn)行下一次組織擴(kuò)繁。

　　3、壯苗及生根培養(yǎng)

　　馬鈴薯組織培養(yǎng)時(shí)，增加細(xì)胞分裂素濃度，可以促進(jìn)增殖系數(shù)的提升。但隨著增殖系數(shù)的增多，會(huì)抑制增殖芽的生長趨勢，不定芽更加細(xì)小，不能進(jìn)行下一步生根培養(yǎng);即使可以進(jìn)行下一步，成活率也會(huì)降低，還需另外進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。馬鈴薯的壯苗培養(yǎng)基為1/3MS+0.05mg·L-1NAA。

　　生根培養(yǎng)是使無根苗生根形成完整植株的過程，這個(gè)過程的目的就是使組培苗生長出濃密而粗壯的不定根，以提高組培苗對外界環(huán)境的適應(yīng)力及馴化移栽的成果率，獲得更多高質(zhì)量的商品苗。馬鈴薯組培苗的生根培養(yǎng)是將未生根的組培苗轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)使其生根的過程。馬鈴薯的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.20mg·L-1NAA，適當(dāng)加大植物生長素的用量，使其快速生根。

　　4、煉苗及移栽

　　馬鈴薯組培苗經(jīng)過生根培養(yǎng)后，便可出瓶移栽。移栽后的組培苗需在特定條件下，如無菌條件、營養(yǎng)、溫度、光照、濕度等，都有較高的要求，要想植物移栽后的生長滿足生長條件，就需要人工創(chuàng)造條件。后期還需使用出瓶種植，讓植物接觸自然環(huán)境，與人工環(huán)境有較大差距，如溫度與濕度等，改變了人為的條件，短時(shí)間中組培苗適應(yīng)不能適應(yīng)。因此，組培苗必須移出培養(yǎng)室，在室溫下煉苗3-5天。

　　移栽前一天揭開封口膜。移栽時(shí)，小心的用手洗去根部附著的培養(yǎng)基，水溫在22℃左右，去掉培養(yǎng)基的苗再用清水洗兩遍，要求認(rèn)真細(xì)心，避免折斷薯苗，清洗后的薯苗再置于一定濃度的殺菌劑溶液中浸泡5min后，立即移栽。按6～8cm的株距移栽入無土培養(yǎng)的基質(zhì)上，擺苗要仔細(xì)，將苗的根系舒展好，覆土后可稍加鎮(zhèn)壓以提墑。移栽后澆透水，注意遮蔭保濕，基質(zhì)在使用前要用高錳酸鉀進(jìn)行消毒，不易過濕，以防爛苗。觀察移栽苗的生長狀況，及時(shí)剔除未成活的組培苗，進(jìn)行種植的常規(guī)管理。

　　二、馬鈴薯組織培養(yǎng)中的污染原因及控制措施

　　1、組培苗污染

　　產(chǎn)生組培苗污染的原因很多，如組織培養(yǎng)附近空氣環(huán)境清潔度不足、過濾設(shè)備設(shè)施失效、相關(guān)器具與器皿中含有其他菌群、植物操作過程不正確等等。造成組培苗污染的病原有很多，主要有細(xì)菌、真菌、內(nèi)源菌等。其中細(xì)菌的污染以芽孢桿菌最為普遍、嚴(yán)重，對其處理主要使用高壓滅菌或者消毒手段。組培苗中產(chǎn)生真菌主要是因?yàn)橹黧w接觸不干凈的物質(zhì)，如灰塵而生長的，在此環(huán)境下，可以通過提升培養(yǎng)環(huán)境與操作環(huán)境方法減少真菌產(chǎn)生。另外植物組織培養(yǎng)過程中，內(nèi)源菌污染的處理工作比較復(fù)雜。該污染指外植體材料內(nèi)部中微生物，此處不能使用一般表面消毒方法清除，主要解決步驟為：①升級外植體的消毒方法，如間隙消毒;②使用前仔細(xì)檢查培養(yǎng)物質(zhì)量，閱讀藥品合格證與使用方法，因?yàn)橛行┪廴拘柙诤荛L時(shí)間之后才表現(xiàn)出來，甚至有些污染很難被發(fā)現(xiàn)，切記不能使用質(zhì)量低或者過期藥品做培養(yǎng)基;③適當(dāng)使用抗生素。

　　2、組培苗玻璃化

　　植物組織培養(yǎng)過程中，經(jīng)常遇見半透明狀的畸形試管苗，對這類植物體叫做“玻璃苗”，此類現(xiàn)象叫做“玻璃化現(xiàn)象”，又稱過度水化現(xiàn)象。組織苗一旦發(fā)生玻璃化，其組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，生理功能產(chǎn)生異常，主要體現(xiàn)為分化能力下降，不能獨(dú)立增殖成芽或者生根，移栽到自然界中更是很難成活。因此要采取防治手段，主要有下面幾點(diǎn)：①使用固體培養(yǎng)方法，提升瓊脂濃度，減少培養(yǎng)基中襯質(zhì)勢。通過此方法可減少玻璃化概率;②適當(dāng)提升培養(yǎng)基中蔗糖比例，降低培養(yǎng)基中的滲透勢，減少植物材料吸收水分量，不會(huì)產(chǎn)生水分脅迫;③注意培養(yǎng)基的通氣，如用棉塞，降低培養(yǎng)容器中空氣濕度，優(yōu)化氧氣供應(yīng);④減少培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和赤霉素的濃度;⑤采取低溫處理手段。⑥增加自然光照;⑦增加培養(yǎng)基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素含量，降低氮氯比例，此處需注意降低銨態(tài)氮濃度，但是盡量提升硝態(tài)氮含量。